酶標儀是一臺變相的光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計幾乎相同。
光源燈發出的光線經過濾光片或單色器后，成為一束單色光束。該單色光束經過塑料微孔板中的待測標本，被標本吸收掉一部分后，到達光電檢測器。光電檢測器將投射到其上面的光信號的強弱變成電信號的大小。此電信號經前置放大、對數放大、模數轉換等模擬信號處理后，送入微處理器進行數據處理和計算。最后由顯示器和打印機將測試結果顯示、打印出來。
微處理機還通過控制電路來控制X、Y方向的機械驅動機構的運動。但對于非自動型的酶標儀，它是用手工來移動微孔板的，可以省去X、Y方向的機械驅動機構及其電路，這樣的儀器體積更小，結構也更簡單。
微孔板是一種用來盛裝待測樣本的透明塑料板，板上有多排小孔，如有40孔板、55孔板和96孔板等多種規格。每個小孔可以盛放零點幾毫升的溶液。根據儀器的不同，既可以一個孔一個孔地檢測，也可以一排孔一排孔地檢測。
酶標儀既可以使用和分光光度計相同的單色器，也可以使用干涉濾光片來獲得單色光。和光電比色計一樣，使用濾光片作過濾裝置時，將濾光片設計到微孔板的前面和后面效果是一樣的。
一般酶標儀的光束既可以設計成從上到下通過比色液，也可以設計成從下到上通過比色。它和普通光電比色計的不同之處在于：一是盛裝比色液的容器不是使用比色皿，而是使用了塑料微孔板，塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，之所以采用塑料微孔板來作固相載體，是利用它對抗原或抗體有較強的吸附這一特點；二是酶標儀的光束是垂直通過待測液的；三是酶標儀通常不使用A而是使用光密度OD來表示吸光度。
酶標儀有單通道和多通道兩種類型，單通道又分為自動型和手動型兩種。其中，自動型的儀器設有X和Y兩個方向的驅動機構，在機械裝置的驅動下，微孔板上的小孔一個個依次進入光束下面測試。手動型靠手移動微孔板來進行測量。
在單通道酶標儀的基礎上，又發展了多通道、全自動型酶標儀。多通道酶標儀一般都是自動型的，它設有多個光束和多個光電檢測器。如8通道的儀器，設有8條光束（或8個光源）、8個檢測器和8個放大器。在機械驅動裝置的作用下，樣品被8個一排、8個一排檢測。多通道酶標儀的檢測速度快，但其結構比較復雜，價格也較貴，多用于大中型醫院。
酶標儀的其他部分的結構，與光電比色計和小型生化分析儀基本相同。